军团菌专题|揪出身边的“隐形杀手”（检测篇）

发布日期：2023-07-31 10:15:03 来源：安远众智作者：安远众智浏览量：1128

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导语

军团菌病是由嗜肺军团菌引起的一种以肺炎为主的全身性疾病，主要通过空气中气溶胶传播。中央空调冷却塔水系统和沐浴用水是主要传染源，有人称其为“现代城市文明病”。在我国被列入新发传染病之一。

自1976年首次爆发流行后，相继在欧洲、澳大利亚等地发现军团菌病例。我国于1982年首次在南京发现病例。30多年来，军团菌病在世界各地的暴发流行引起了WHO及各国政府和卫生部门的高度重视。

军团菌检测的必要性

Necessity of Legionella detection

军团菌病在一年四季均能发生，夏秋季尤为猖獗。由于没有有效的疫苗，军团菌的防治主要是阻断其生长和繁殖，水源管理与定期检测是目前的主要手段。国际标准化组织把水源中军团菌的检测作为水质标准细菌学检查的一部分，我国也出台了标准《公共场所集中空调通风系统卫生规范（WS/T394-2012)》，明确要求送风指标中嗜肺军团菌不得检出。

需注意的是，环境中的军团菌主要寄生在原虫或生物膜中，并借助空气中的气溶胶传播；当受到外界不利刺激时（如不利的营养、pH、温度、消毒剂等）其可进入活的非可培养状态（viable but non-culturable,VBNC），待条件合适时，又能恢复活力和致病性。军团菌的传播性、致病性和环境隐蔽性给检测提出了更高要求。综合来看，要做好有效防治，军团菌的检测需满足①即时性，即能够快速获取检测结果，做到早检测、早治理，快速阻断病菌传播；②全面性，军团菌检测应尽量覆盖其1-15血清型及潜在的VBNC（活的非可培养状态）细菌；③安全性，应最大程度保障检测人员的安全，并能方便操作，从而扩大检测范围和频率。

目前常用的军团菌的检测方法包括分离培养法、PCR检测法和胶体金免疫层析法等，这些方法互有优缺点，一定程度上满足了检测需求。本期军团菌专题为您带来军团菌常见检测方法的介绍，旨在为军团菌防控提供帮助。

壹

胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析技术是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带),运用可目测的标记物(胶体金)而得到直观的实验现象(显色)。

胶体金免疫层析技术近年来实现了快速迭代升级，目前可以便捷、快速、准确和无污染地进行检测操作，同时有能力检测VBNC（活的非可培养）细菌。因此胶体金试纸成为目前进行军团菌快速检测的主要方法之一。

贰

分离培养法

分离培养法是军团菌检测的传统方法，以细菌的生长繁殖并目视观察到菌落形成等为基础。由于军团菌营养要求特殊，检测周期长，需要时间为3~5天，最长可达到14天。

分离培养法是目前军团菌活菌检测最常用的方法，被认为是检测的“金标准”。但该方法存在回收率低（回收率仅>64%）的问题，且在杂菌严重或细菌处于VBNC状态时难以应用，检测所需时间长，不能满足快速检测的要求。

叁

酶底物定量法

酶底物法是一种以细菌酶检测技术为基础，基于最可能数（most probable number, MPN）方法的定量检测方法。嗜肺军团菌利用酶底物试剂中丰富的氨基酸、维生素和其他营养成分迅速生长繁殖，同时会利用额外添加的酶底物反应生成一种棕色的指示物使溶液显褐色或者浑浊。

酶底物法可以单次检测多个样本，并能检测到非常低浓度的待测物质，可以选择特定的底物和酶，从而提高其特异性。但正是由于酶底物法的适用范围受底物和酶的限制，因此在某些情况下无法适用，受干扰影响大。

肆

酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定抗体或抗原的存在。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。但酶联免疫吸附法本身并不能直接确定产生反应的是哪种细菌，无法对这些成分做出鉴定。同时，ELISA作为一种实验室技术，在水体军团菌检测中通常需要在合格的实验室环境下由专业的检测人员进行操作，以确保结果的可靠性。

伍

PCR法

PCR检测法是基于膜完整性进行的检测。活细胞由于具有完整的细胞膜结构，可以将DNA的一些特异经膜的结合染料排除在外，而死细胞和膜损伤细胞则无法组织染料的进入。EMA-PCR法检测快速，可特异性区分死菌与活菌，与荧光定量PCR结合还可进行定量检测。

PCR法是一种快速、敏感且可靠的检测方法。但相比传统的培养方法，PCR法的设备和试剂成本较高，检测过程对操作人员的专业知识有较高要求。且由于PCR法对DNA非常敏感，并不能区分死菌与活菌，容易出现假阳性结果。

陆

免疫荧光法

免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。再利用荧光显微镜观察细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上受激发光的照射而发出明亮的荧光反应(黄绿色或桔红色)，最终利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。